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    公开号:WO1992009692A1
    申请号:PCT/JP1991/001606
    申请日:1991-11-22
    公开日:1992-06-11
    发明作者:Hideaki Negishi；Hiroshi Tanaka；Tetsuji Yamada
    申请人:Japan Tobacco Inc.；
    IPC主号:C12R1-00
    专利说明:
    [0001] 明 糸田
    [0002] 1. 発 明 の 名 称
    [0003] 非 病 原 性 化 プ 転 換 体
    [0004] 2. 技 術 分 野 こ の 発 明 は、 非 病 原 性 化 プ ラ ス ミ ド に 関 し、 さ ス
    [0005] ら に 詳 し く は 植 物 寄 生 細 菌 で あ る シ ュ 一 ド モ ナ ス • ソ ラ ナ セ ァ ラ ム (Pseudomonas solanacearum) CO 非 病 原 性 突 然 変 異 株 で あ る M 4 S 菌 由 来 で あ り、 か つ シ ユ ー ド モ ナ ス 属 の 病 原 性 細 菌びを 非 病 原 性 化 し て 無 毒 化 す る プ ラ ス ミ ド に 関 す る も の で あ る c 病
    [0006] ま た、 こ の 発 明 は、 上 記 非病 原 性 化 プ ラ ス ミ ド を シ ュ 一 ド モ ナ ス 属 の 細 菌 に 導 入 す る こ と に よ り 得 ら れ る 非 病 原 性 形 質 転'換 体 に 関 す る。 質
    [0007] 3. 背 景 技 術
    [0008] シ ユ ー ド モ ナ 属 細 菌 は イ ネ の 籾 枯 れ 細 菌 病、 ナ ス 科 植 物 の '青 枯 病、 タ バ コ 立 枯 病 等 を 起 こ す 細 菌 で あ り、 こ れ ら の 病 気 に よ る 被 害 は 農 業 上 大 き な 問 題 と な っ て い る。 こ れ ら の 病 気 に 対 し て、 同 種 の 非 病 原 性 菌 を 用 い た 生 物 防 除 が 試 み ら れ て い
    [0009] ま た、 シ ユ ー ド モ ナ ス 属 細 菌 に は、 土 壌 '伝 染 性 の 植 物 病原 菌 に 拮抗 作用 を 示 す も の も あ り、 生 物 防 除 用 の 細 菌 と し て 用 い る こ と が 試 み ら れ 一部 で は 実 用 ィヒ さ れ て い る。
    [0010] し か し、 こ れ ら の 生物 防 除用 の 細 菌 は、 自 然誘 発 の 突 然変 異 力、、 あ る い は 土壌 中 か ら の 選 抜 に 由 来 す る も の で あ る。
    [0011] こ の よ う な 突然変 異 ま た は 選 抜 に よ る 方 法 は、 多 大 の 労 力 を 要 し、 さ—ら に 必 ず し も 必 要 な 性 質 を 全 て 持 つ も の が得 ら れ る と は 限 ら な い。
    [0012] し た 力 つ て、 よ り 合理 的 な 選 抜 方 法 と し て、 遺 伝 子 操 作 が 考 え ら れ る 力 シ ユ ー ド モ ナ ス 属細 菌 の 病原 性 菌 を 非病 原 性化 す る よ う な 手 段 は、 ト ラ ン ス ポ ゾ ン 等 の 無 作 為 的 な 方法 を 除 い て 見 出 さ れ て い な い。
    [0013] ま た、 シ ユ ー ド モ ナ ス 属 細 菌 の 中 に は、 人 間 等 に 感 染 症 を 引 き 起 こ す も の も 知 ら れ て お り、 こ れ ら を 無 毒ィヒ す る こ と は 医 学 上 重 要 で あ る と 考 え ら. れ 。
    [0014] し た が つ て、 こ の.発 明 は、 簡 便 か つ 安定 に 供給 さ れ る、 シ ユ ー ド モ ナ ス 属 の 非 病 原 性 菌 を 提 供す る こ と を 百 的 と す る。
    [0015] 4. 発 明 の 開 示
    [0016] 本 発 明 者 ら は、 植 物寄 生 細 菌 で あ る シ ユ ー ド モ ナ ス 属 細 菌 に つ い て 種 々 検 討 し た。 そ の 結 果、 シ ユ ー ド モ ナ ス · ソ ラ ナ セ ァ ラ ム の 非 病 原 性 突 然 変 異 株 M 4 S 菌 か ら 病 原 性 野 生 株 に は 存 在 し な い プ ラ ス ミ ド を 分 離 す る こ と に 成 功 し、 さ ら に こ の プ ラ ス ミ ド に 薬 剤 耐 性 を 付 与 し、 シ ュ ー ド モ ナ ス 属 細 導 入 す る こ と に よ っ て 非 病 原 性 化 す る こ と に も 成 功 し た。
    [0017] こ の 発 明 の プ ラ ス ミ ド は、 シ ユ ー ド モ ナ ス · ソ のミ
    [0018] ラ ナ セ ァ ラ ム の 非 病 原 性 突 然 変 異 株 で あ る
    [0019] プド M 4 S 由 来 の プ ラ ス ミ ド で あ っ に口こ、 シ ュ 一 ド モ ナ ス 属 の 病 原 性 細 菌 を 非 病 原 性 化 し、 無 毒 化 す る こ と を 特 徴 と し、 よ り 好 ま し く は、 約 6 . 6 2 k b p の 分 子 量 を 有 し、 か つ 第 1 図 に 示 さ れ る 制 限 酵 素 地 図 を 有 し て い る。 - な お、 シ ュ. 一 ド モ ナ ス · ソ ラ ナ セ ァ ラ ム M 4 S は、 P 本 国 茨 城 県 筑 波 郡 谷 田 部 町 東 1 丁 目 1 番 3 号 （ 郵 便 番 号 3 0 5 ) に あ る 通 商 産 業 省 工 業 技 術 院 微 生 物 工 業 技 術 研 究 所 に、 昭 和 5 8 年 （ 1 9 8 3 年 ） 1 2 月 1 4 曰 付 で 微 ェ 研 菌 寄 第 7 3 7 0 号 • ( F E R M' P - 7- 3 7 0 ) と し て 寄 託 さ れ て い た がヽ そ の 後 昭 和 6 0 年 （ 1 9 8 5 年 ） 1 月 2 4 日 付 で 同 所 の 国 際 寄 託 に 移 管 さ 受 託 番 号 が 微 ェ 研 条 寄 第 7 0 0 号 ( F E R M B P - 7 0 0 ) と 変 更 さ れ た。 ま た、 上 記 ブ ラ ス さ ら に 薬 剤 耐 性 遺 伝 子 お よ び こ の 遺 伝 子 モ ー タ ー 遺 伝 子 が 組 み 込 ま れ た プ ラ ス ミ ド も こ の 発 明 の 範 囲 に あ り、 好 ま し く は 分 子 量 力 約 9 . 0 9 k b p で あ り、 第 2 図 に 示 さ れ る 制 限 酵 素 地図 を 有 し て い る。
    [0020] ま た、 こ の 発 明 の 非病 原 性形 質 転換 体 は、 シ ュ ー ド モ ナ ス 属 の 細 菌 で あ っ て、 そ の 菌 体 内 に 上記 い ずれ か の プ ラ ス ミ ド を 有 す る こ と を 特 徴 と す る- こ の 菌 か ら の 上 記 プ ラ ス ミ ド の-抽 出 は、 常 法 に 従 っ て 行 な う こ と 力 で き る。
    [0021] 例 え ば、 ま ず、 カ ザ ミ ノ 酸 （ D if co 社 の 商 品 名、 酸 に よ る カ ゼ イ ン の 加 水 分 解物 ）、 ペ プ ト ン、 グ ル コ ー ス 等 を 栄 養 源 と し、 pH 7 〜 8 程 度 の 液 体 培 地 に お い て、 2 8 〜 3 0 °C で 1 0 〜 2 4 時 間 程 度 菌 を 振 と う 培 養 す る。
    [0022] . 次 に、 培 養 し た 菌 を ア ル カ リ 性 界面 活 性 剤 で 溶 菌 し、 ポ リ エ チ レ ン グ リ コ ー ル を 添 加 し て 菌 体 内 成分 を 沈 澱 凝 集 さ せ る。
    [0023] こ の 沈 澱 物 を 常 法 に よ り 除 蛋 白 し、 次 い で、 ァ ル コ ー ル-沈 澱 に よ っ て 核酸 を 回 収 し た 後、 ヒ ド ロ キ シ ァ パ タ イ ト カ ラ ム を 用 い た 高 速 液体 ク ロ.マ ト グ ラ フ ィ で 精 製 し て 目 的 と す る プ ラ ス ミ ド を 得 る = こ の プ ラ ス ミ ド は、 分 子 量 力 約 6 . 6 2 k b p の 環状 2 本鎖 D N A で あ り、 第 1 図 に 示 す 制 限 酵 素 地 図 を 有 す る （ 以 下、 こ の プ ラ ス ミ ド を P J T P S 1 と 呼 ぶ こ と 力 あ る ）。
    [0024] 次 に、 上 で 得 ら れ た プ ラ ス ミ ド に マ 一 カ ー と な る 遺 伝 子 を 組 み 込 む。
    [0025] こ の 際、 マ ー カ 一 と し て は、 通 常薬 剤 耐 性 遺 伝 子 力 用 い ら れ る。
    [0026] 例 え ば、 マ ー カ ー と し て ノヽ ィ グ ロ マ イ シ ン 耐 性 遺 伝 子 を 組 み 込 む 場 合 に は、 得 ら れ た プ ラ ス ミ ド を 制 限 酵 素 H ί n d ffl で 切 断 し、 こ の 切 断 部 位 に 第 3 図 に 示 す プ ラ ス ミ ド p T 0 M 1 [ 西 野、 山 田、 白 石、 奥 （ 岡 山 大 学 農 学 部 植 物 病 学 教 室 ） に よ る二 由 来 で プ ロ モ ー タ ー 遺伝 子 を 含 む ノヽ ィ ク、、 ロ マ ィ シ ン 耐 性 遺 伝 子 を 連 結 す れ ば よ い。
    [0027] 第 3 図 に お い て、 h p h は ハ ィ グ ロ マ イ シ ン 遺 云 子、 p r o は プ ロ モ ー タ ー 遺 伝 子 を そ れ ぞ れ 示 す。
    [0028] こ の ハ イ グ ロ マ イ シ ン 耐 性 遺 伝 子 は、 制 限 酵 素 H i n d IE と B a m H I に よ っ て 切 断 さ れ る、 約 2 . 4 5 k b p の 断 片 で あ る。
    [0029] マ 一 カ ー を 組 み 込 ん だ プ ラ ス ミ ド は、 常 法 に よ り シ ユ ー ド モ ナ ス 属 細 菌 に 導 入 す る。 こ れ に よ り 細 菌 が 形 質 転 換 さ 非 病 原 性 細 菌 が 得 ら れ る。
    [0030] こ の 形 質 転 換 体 力、 ら 上 記 と 同 様 の 方 法 に よ つ て 抽 出 さ れ た プ ラ ス ミ ド は、 分 子 量 が 約 9 . 0 9 k b P の 環 状 2 本 鎖 D N A で あ り、 第 2 図 に 示 さ れ る 制 限 酵 素 地 図 を 有 す る も の で あ る ( 以 下、 こ の プ ラ ス ミ ド を p J T P .S 2 と 呼 ぶ こ と が あ る）。 5. 図 面 の 簡 単 な 説 明
    [0031] 第 1 図 は、 本発 明 に よ る プ ラ ス ミ ド p' J T P S
    [0032] 1 の 制 限酵素 切 断地 図 で あ る。
    [0033] 第 2 図 は、 本発 明 に よ る プ ラ ス ミ ド p J T P S
    [0034] 2 の 制 限酵素 切 断 地 図 で あ る。
    [0035] 第 3 図 は、 プ ラ ス ミ ド p T 0 M 1 に お け る ハ イ グ ロ マ イ シ ン 耐性 遺 伝子 の 位 置 を 示 す 制 限 酵 素 切 断地 図 で あ る。 ，
    [0036] 6. 発 明 を 実 施 す る た め の 最良 の 形態
    [0037] 以 下、 実 施 例 に よ り、 こ の 発 明 を 具 体 的 に 説 明 す る が、 こ の 発 明 は こ れ ら に 限 定 さ れ る も の で は な い。
    [0038] ( 1 ) 菌 の 培 養
    [0039] シ ユ ー ド モ ナ ス ， ソ ラ ナ セ ァ ラ ム M 4 S を 1 niS の C P G 液体 培地 （ 0 . 1 % カ ザ ミ ノ 酸 、 1 % ぺ ブ ト ン 、 1 % グ ル コ ー ス ） に 接種 し 、 3 0 °C で 約 1 8 時間 振 と う 培 養 し た。
    [0040] そ の 後、 2 5 0 ηιβ の C P G 液 体 培地 に 植 え 継 ぎ、 さ ら に 約 1 8 時 間 振 と う 培 養 し た。
    [0041] ( 2 ) プ ラ ス ミ ド の 調製
    [0042] 上記 （ 1 ) で 得 ら れ た 培 養 液 を 6 5 0 0 rpffl で 2 0 分 間 遠心 し、 集 菌 し た。 こ の 菌 体 を 1 5 m M — N a C 1 で 洗 浄 し て 再 び
    [0043] 2 0 ιιώ の 1 5 m M — N a C l に 懸 濁 し、 1 4 0 ι,,ί の 溶 菌 溶 液 （ 3 % S D S、 5 0 m M ト リ ス 塩 酸、
    [0044] 3 0 m M E D T A 、 5 m M N a C l , pH 1 2 . 4 5; を 加 え、 5 0 °C で 1 0 分 間 静 置 し た。
    [0045] 次 い で、 静 力、 に 混 ぜ な が ら、 2 M ト リ ス 塩 酸 ( pH 5 . 5 ) で pHを 8 〜 9 に 再 調 整 し、 さ ら に 5 0 ιδ の 5 Μ — N a C 1 を 加 え て 静 カ、 に 混 合 し た。
    [0046] 次 い で、 氷 上 に 1 時 間 以 上 静 置 し た 後、 1 5 0 0 0 rpm か つ 4 °C で 1 5 分 間 遠 心 し た。
    [0047] 遠 心 後、 上 清 を 集 め て キ ム ワ イ プ で ろ 過 し、 5 分 の 1 の 量 の P E G 溶 液 [ 6 0 % ポ リ エ チ レ ン グ リ コ 一 ノレ 6000、 1 0 m M ト リ ス 塩 酸 （ p H 8 . 0 ) ] を 加 え、 氷 上 に 1 時 間 以 上 静 置 し た。
    [0048] こ れ を 1 5 0 0 0 rpm か つ 4 °C で 3 0 分 間 遠 心 し、 上 清 を 捨 て て 沈 澱 物'を 得 た。
    [0049] 得 ら れ た 沈 澱 物 を 少 量 の T E N 緩 衝 液 [ 5 0 m M ト リ ス 塩 酸 （ pH 8 . 0 ) 、 3 0 m M E D T A、 5 m M N a C 1 ) ; に 溶 解 し、 フ エ ノ ー ノレ 一 ク ロ ロ ホ ル 厶 処 理 に よ 'つ て 除 蛋 白 を 行 な い、 さ ら に ェ タ ノ ー ル 沈 澱 に よ つ て 脱 塩 洗 浄 し た。
    [0050] こ こ で、 フ エ ノ ー ノレ 一 ク ロ ロ ホ ノレ ム 処 理 は 次 の よ う に 行 な つ た。
    [0051] ま ず、 等 量 の T E 緩 衝 液 飽 和 フ ヱ ノ ー ノレ ー ク 口 ロ ホ ノレ ム ー ィ ソ ァ ミ ノレ ア ノレ コ 一 ノレ （ 2 5 ： 2 4 ： 1 ) を 加 え て 振 と う し、 こ れ を 遠心 し て 水 層 を 回 収 し た。
    [0052] こ れ を 数 回 繰 り 返 し、 さ ら に ク ロ 口 ホ ル ム ー ィ ソ ァ ミ ノレ ア ノレ コ 一 ノレ （ 2 4 : 1 ) を 等 量 加 え て 振 と う し、 遠心 し て 水 層 を 集 め た。
    [0053] ま た、 エ タ ノ ー ル 沈澱 は、 以 下 の よ う に 行 な つ た。
    [0054] ま ず、 0 . 1 倍量 の 3 M — 酢 酸 ナ ト リ ウ ム 及 び 2 . 5 倍量 の エ タ ノ ー ル を 加 え て 攪拌 し、 一 7 0 °C で 3 0 分 間 静 置 し た。
    [0055] 次 に、 1 5 0 0 0 rpm か つ 4 °C で 3 0 分 間 遠 心 し て D X A を 沈 潑 さ せ、 上 清 を 除 い た。
    [0056] そ の 後: 7 0 % エ タ ノ ー ル で 洗 浄 し、 乾 燥 し た 得 ら れ た D N A を 2 mJ3 の 殺 菌 蒸 留 水 に 溶 解 し、 高 速 液 体 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ を 用 い て プ ラ ス ミ ド を 精製 し た。.
    [0057] 高 速 液体 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ の 条 件 は 以 下 の 通 り - で あ る。
    [0058] 装 置： 日 立 6 5 5 · 1 5
    [0059] 検 出： U V 2 6 0 n m
    [0060] カ ラ ム： ヒ ド ロ キ シ ア パ タ イ ト 充 塡 カ ラ ム （ 三 井 東 圧 化 学 H C A - column A - 8 0 1 0 G ) 遊離 液： リ ン 酸 カ リ ウ ム 緩 衝 液
    [0061] 0 〜 2 0 分 間 l O O m M
    [0062] 2 0 〜 3 0 分 間 2 0 0 m M 3 0 5 0 分 間 3 0 0 m M 流 速 1 . 0 mS /分
    [0063] <皿 1又 全 ¾m.
    [0064] B3 料 量： 1 mS '
    [0065] 2 O O m M の 画 分 で 溶 出 し た プ ラ ス ミ ド を 分 取 し、 T E 緩 衝 液 に 対 し て 4 °C で ー 晚 透 析 し、 リ ン 酸 を 除 い た。 こ れ を エ タ ノ ー ル 沈 澱 に よ っ て 脱塩
    [0066] Ϊ辰 縮 し た 後 T E 緩 衝 液 に 溶 解 し、 — 2 0 で 保存 *-o
    [0067] ま た、 . プ ラ ス ミ ド の 精 製 は、 塩 化 セ シ ウ ム に よ る 平 衡 密 度 勾 配 超 遠 心 に よ つ て も 可 能 で あ つ た。
    [0068] ( 3 ) 制 限 酵 素 に よ る 切 断
    [0069] 上 記 （ 2 ) .で 得 ら れ た プ ラ ス ミ ド p J T P S 1 O 分 子 量 を 算 出 し、 制 限 酵 素 地 図 を 作 成 す る た め に、 各 種 制 限 酵 素 で 切 断 じた。
    [0070] 制 限 酵 素 は 宝 酒 造 社 お よ び 日 本 ジ ー ン 社 の 製 品 を 使 用 し、 切 断 条 件 は 製 造 者 の 指 定 す る 条 件 に 従 ό た 0
    [0071] 切 断 し た 試 料 を、 以 下 の 手 順 で ァ ガ ロ ー ス ゲ ル 電 気 泳 動 に か け た。
    [0072] ま ず、 0 . 5 g / inS の ェ チ ジ ゥ ム ブ 口 マ イ ド を 含 む 0 . 7 % 1 . 2 % お よ び 2 % の ァ ガ 口 一 ス ゲ ル の 各 々 に 切 断 し た 試料 を の せ、 0 . 5 β g / mil の ェ チ ジ ゥ ム ブ 口 マ イ ド を 含 む T B E '緩 衝 液 中 に お い て 5 0 V の 一定 電 圧 で 2 〜 4 時 間 の 泳 動 を 行 な い、 切 断片 を 分 離 し た。
    [0073] 制 限 酵素 切 断 片 の 検 出 は、 3 0 0 n m 紫 外 線 照 射 下 で D N A 断片 の 移動 位 置 を 検 出 し て 写 真 撮影 す る こ と に よ り 行 な つ
    [0074] 各制 限酵 素 に よ る 断片 か ら 算 出 さ れ た プ ラ ス ミ ド p J T P S l の 分 子量 は、 約 6 .6 2 k b p で あ つ' す：。
    [0075] 切 断 片 の 分 子量 測 定 マ ー カ ー と し て 〖ま、 λ フ ァ — ジ の D Ν Α を 制 限 酵 素 H i n d m ま た は S t y
    [0076] I で 消 化 し て 得 ら れ た 断 片 を 使 用 し た。
    [0077] こ の よ う に し て 測 定 さ れ た 各 種 制 限 酵 素 に 対 す る プ ラ ス ミ ド p J T P S l の 感 受 性 を 第 1 表 に 示 し た。
    [0078] ま た、 こ の プ ラ ス ミ ド の 制 限 酵 素 切 断 地 図 は 第 1 図 に 示 す 通 り で あ る。
    [0079] 第 1 図 に お い て、 切 断 位'置 は E c 0 R I の 切 断 位 置 を 座-標点 と. し て、 k .b p ( キ ロ 塩 基 対 ） で 表 示 し た。
    [0080] ( 以 下 余 白 ） 第 1 表
    [0081] 制 限 酵 素 切 断 数 1 切 断 位 置 （k b p )
    [0082] A p a I 1 3 . 1 1
    [0083] E c 0 R I 丄 0 / 6 6 2
    [0084] E c 0 R V 1丄 3 . 7 5
    [0085] H i n d m 1 3 . 5 7
    [0086] P s t I 4 1 . 1 3 1 2 . 2 4
    [0087] 3 . 4 3 / 3 . 9 7
    [0088] S t u I 1 1 . 7 8
    [0089] X h 0 I 1 1 . 8 3 ！ j
    [0090] A c c I 2 測 定 せ ず
    [0091] B g 1 Π 2 測 定 せ
    [0092] S a 1 I 2 測 定 せ ず
    [0093] ( 4 ) 組 換 え D X A の 作 成
    [0094] a ) イ ン サ ー ト D N A ( プ ロ モ ー タ 一 遺 伝 子 と ハ イ グ ロ マ イ シ ン 耐 性 遺 伝 子 ） の 調 製
    [0095] プ ラ ス ミ ド p T 0 M 1 を 制 限 酵 素 H i n d ΠΙ と B a m H I で 消 化 し、 以 下 の 手 順 に 従 っ て 低 融 点 ァ ガ ロ ー ス ゲ ル 電 気 泳 動 に か け た。
    [0096] ま ず、 0 . 5 〃 g ン inS の ェ チ ジ ゥ ム ブ 口 マ イ ド を 含 む 0 . 7 % の 低 融 点 ァ ガ ロ ー ス ゲ ル に 切 断 し た 試 料 を の せ る。
    [0097] 次 に、 0 . 5 μ g mfi の ェ .チ ジ ゥ ム ブ ロ マ イ ド を 含 む T B E 緩 衝 液 中 に お い て 5 0 V の 一 定 電 圧 で 2 〜 4 時 間 の 泳 動 を 行 な ·い、 切 断 片 を 分 離 す る。 分 離 し た D N A 断 片 の 移 動 位 置 を 3 6 0 n m 紫 外 線 照 射下 で 検 出 し、 約 2 .4 7 k b p の 断 片 を 含 む ゲ ル 部 分 を か み そ り で 切 り 出 し て 6 5 °C に 保 温 し 完 全 に 溶解 さ せ ナ:。 - こ れ に 2 倍 量 の T E 緩衝 液 を 加 え、 フ ヱ ノ ー ル 一 ク ロ ロ ホ ノレ ム 処 理 を 行 な い、 さ ら に ェ チ ル エ ー テ ノレ処 理 を 行 な つ "o
    [0098] そ の 後、 ェ タ ノ， ー ル沈 澱 を行 な っ て 洗 浄 し、 乾 燥 さ せ た。
    [0099] で、 ェ チ ル エ ー テ ル 処理 は 次 の 手 順 つ た
    [0100] ま ず、 ェ チ ル エ ー テ ル を 等量 加 え て 振 と う し、 遠心 し " Γ水 層 を 回 収 す る。
    [0101] こ れ を 3 回 繰 り 返 し、 さ ら に 窒 素 ガ ス を 用で い て 残 っ た ェ チ ル エ ー テ ル を 除 去 す る。 亍
    [0102] b) ベ ク タ ー D N A ( p J T P S l ) の 切 断 上 記 （ 2 ) で 得 ら れ た プ ラ ス ミ ド を 制 限 酵 素 H i n d H [ で 切 断 し、 1 / 1 0 量 の 1 0 % S D S と 0 . 5 M E D T A を 加 え 7 5 。C で 1 5 分 間 加 温 し た。
    [0103] フ ェ ノ ー ル ー ク 口 口 ホ ル ム 処 理 お よ び ェ チ ル ェ — テ ル 処理 を 行 な い、 エ タ ノ ー ル 沈 澱 に よ っ て 洗 浄 し て、 乾 燥 さ せ た。 c ) イ ン サ ー ト A と べ ク タ — D N A の 連 結 上 記 a )お よ び b )で 得 ら れ た D N A を T 4 D N A リ ガ ー ゼ で 連 結 し、 1 1 0 量 の 1 0 % S D S と
    [0104] 0 . 5 M E D T A を 加 え て 7 5 °C で 1 5 分 間 加 温 し /
    [0105] 次 に、 フ ェ ノ ー ノレ 一 ク ロ ロ ホ ノレ ム 処 理 お よ び ェ チ ル ェ 一 テ ル 処 理 を 行 な い、 エ タ ノ ー ル 沈 澱 に よ つ て 洗 浄 し て 乾 燥 さ せ た。
    [0106] 次 い で、 D N A の 両 末 端 を ラ ー ジ フ ラ グ メ ン ト E. c 0 1 i D N A ポ リ メ ラ ー ゼ I で 平 滑 末 端 と し た 後、 1 / 1 0 量 の 1 0 % S D S と 0 . 5 M E D T A を 加 え て 7 5 °C で 1 5 分 間 加 温 し 、 フ エ ノ 一 ノレ 一 ク ロ 口 ホ ル ム 処 理 お よ び ェ チ ノレ エ 一 テ ル 処 理 を 行 な い、 エ タ ノ ー ル 沈 澱 に よ つ て 洗 浄 し て 乾 燥 さ せ た。
    [0107] そ の 後、 D N A の 両 末 端 を T 4 D N A リ ガ 一 ゼ で 連 結 し、 環 状 2 本 鎖 の D 1' A ( プ ラ ス ミ ド p J T P S 2 ) を 得 た。
    [0108] な お、 T 4 D N A リ ガ ー ゼ お よ び ラ ー ジ フ ラ ク メ ン 卜 E. c ' 0 1 i D N A ポ リ メ ラ 一 ゼ I は 宝 S 造 社 の 製 品 を 使 用 し、 反 応 条 件 は 製 造 者 の 指 定 す る 条 件 に 従 つ た。 Ik
    [0109] ( 5 ) シ ュ 一 ド モ ナ ス ' ソ ラ ナ セ ァ ラ ム の 形 質転 換
    [0110] 上 記 （ 4 ) で 得 ら れ た D N A を 用 い て シ ユ ー ド モ ナ ス · ソ ラ ナ セ ァ ラ ム の 病原性野生 菌株 U — 7 の 形 質 転換 を Boucherら の 方法 [ Journal of
    [0111] General Microbiology , vol .131 , 2449-2457 (19 85) ] に 準 じ て 下 記 の 通 り に 行 な つ す
    [0112] ま ず、 グ ノレ コ ー ス （ 0 . 2 % ) と グ リ セ 口 一 ノレ ( 4 mS X β ) を 添 加 し た Μ Μ培地 [ 1 ノ 4 の 濃 度 の Μ 6 3 培 地 （Maniatis et a 1. , 1982 , Molecular Cloning , A Laboratory Manual) ] 【こ お て 3 0 °C で 5 X 1 0 e 個 ま で 培 養 し た U — 7 菌 5 0 z 2 を、 上 記 （ 4 ) で 得 た D N A 7 · 6 5 ^ g と 混合 し、 グ リ セ ロ ー ル （ 4 ι,ιβ / 2 ) を 添加 し た Μ Μ 寒 天 培 地 上 に 移 し た。
    [0113] こ れ を 3 0 °C で 4 8 〜 6 0 時間 培養 し た 後、 菌 体 を 2 0 χ の 殺菌 水 に 再 懸 濁 し、 そ の 1 0 0 ; β - を ノヽ ィ グ ロ マ イ シ ン （ 3 0 ppm ) と 2 , 3 , 5 卜 リ フ ェ ニ ル 塩 ィ匕 テ ト ラ ゾ リ ゥ ム （ 0 . 0 5 % ) を 添 加 し た C P G 寒天 培地 上 に 広 げ、 3 0 で 2 4 〜 7 2 時 間 培 養 し た。
    [0114] 出 現 し た ハ イ グ ロ マ イ シ ン 耐性 菌 の コ ロ ニ ー 数 を 計 測 し、 形 質 転 換 劾 率 を 計算 し ^
    [0115] 上 記 の 条 件 で は、 形 質 転換効率 は、 D N A 1 i g 当 り 約 1 . 2 X 1 0 コ ロ ニ ー で あ っ た。 こ こ で、 得 ら れ た 形 質 転 換 体 は、 日 本 国 茨 城 県 筑 波 郡 谷 田 部 町 東 1 丁 目 1 番 3 号 （ 郵 便 番 号 3 0 5 ) に あ る 通 商 産 業 省 工 業 技 術 院 微 生 物 工 業 技 術 研 究 所 に、 平 成 2 年 （ 1 9 9 0 年 ） 9 月 2 8 日 付 で 微 ェ 研 菌 寄 第 1 1 7 4 6 号 （ F E R M P — 1 1 7 4 6 ) と し て 寄 託 さ れ て い た 力 そ の 後 平 成 3 年 （ 1 9 9 1 年 ） 1 1 月 1 1 日 付 で 同 所 の 国 際 寄 託 に 移 管 さ 受 託 番 号 が 微 ェ 研 条 寄 第 3 6 5 0 号 （ F E R M B P — 3 6 5 0 ) と 変 更 さ れ た。
    [0116] ( 6 ) 組 換 え D N A の 抽 出、 精 製 と 確 認
    [0117] 上 記 （ 5 ) で 出 現 し た ハ イ グ ロ マ イ シ ン 耐 性 菌 力、 ら 上 記 （ 1 ) お よ び （ 2 ) と 同 様 の 方 法 で ブ ラ ス ミ ド を 抽 出 し、 精 製 し た。 '
    [0118] 得 ら れ た プ ラ ス ミ ド に 対 し て は、 ノ、 ィ グ ロ マ イ シ ン 耐 性 遺 伝 子 を プ ロ ー ブ と し て 用 い る サ ザ ン ブ ロ ッ テ ィ ン グ 法 で 組 換 え D N A の 確 認 を 行 な つ ナ:— な お、 プ ロ 一 ブ 作 成 に は、 宝 酒 造 社 製 ラ ン ダ ム プ ラ イ マ 一'ラ ベ リ ン グ キ ッ ト を 使 用 し、 製 造 者 の 指 定 す る 条 件 に 従 っ て 作 成 し た。
    [0119] ま た、 揷 入 し た D N A の 方 向 性 を 確 認 す る た め に 制 限 酵 素 H i n d m お よ び E c o R V を 用 い て、 上 記 （ 3 ) と 同 様 の 方 法 で 分 析 し た。
    [0120] こ の よ う に し て 作 成 し た プ ラ ス ミ ド P J T P S 2 の 制 限 酵 素 地 図 は 第 2 図 に 示 す 通 り で あ る。 図 中、 切 断 位 置 は. E c 0 R I の 切 断 位 置 を 座 標 点 と し て、 k b p で 表示 し た。
    [0121] な お、 制 限 酵 素 R s · a I、 S a c Π お よ び S a 丄 I に よ る 切 断位 置 に つ い て は、 イ ン サ ー ト D N A の 部 分 の み を 示 し た。
    [0122] ( 7 ) 形質 転 換 体 の 諸性 質 - a ) コ ロ ニ ー 形 態
    [0123] 上 記 （ 5 ) で 得 ら れ た 形 質転 換 体 と M 4 S 菌 ぉ よ び U — 7 菌 を、 2 , 3 , 5 ト リ フ エ 二 ノレ 塩 化 テ ト ラ ゾ リ ゥ ム （ 0 . 0 5 % ) を 添加 し た C P G 寒天 培 地 上 に 広 げ、 3 0 °C で 2 4 〜 7 2 時 間培 養 し、 コ ロ 二 一 形 態 を 比 較 し た。
    [0124] じ 一 7 菌 は 病原 性 菌 に 特 徴 的 な 流動 型 の コ ロ ニ 一 形 態 を 示 し た 力、 形 質転 換 体 は 全 て M 4 S 菌 と 同 じ 非 病原 性 菌 に 特 徴 的 な 非流 動 型 の コ ロ ニ ー 形 態 を 示 し た。 b ) ト マ ト に 対 す る 病 原 性 — 1
    [0125] 上 記 （ 5 ) で 得 ら れ た 形 質転 換 体 と M 4 S 菌 ぉ よ び U — 7 菌 を、 播 種後 1 週 間 の ト マ ト の 幼 苗 に 有傷 接 種 し 病 原 性 を 検討 し た。
    [0126] 播種 後 1 週 間 の ト マ ト に 対 す る 各菌 種 の 病 原 性 を 第 2 表 に 示 す。 第 2 表 中、 * 印 は 形 質転 換 体 を 示 す。 第 2 表 に 示 す よ う に、 U — 7 菌 を 接 種 し た ト マ ト は 1 週 間 後 に は 1 0 0 % 発 病 し 萎 凋 し た が、 形 質 転 換 体 と M 4 S 菌 は 全 く 病 徴 を 示 さ な か っ た。 第 2 表
    [0127] 株 発 病 率 （％ ) ；
    [0128] U 一 7 1 0 0 1
    [0129] M 4 S 0
    [0130] U 一 7： P J T Ρ S 2 - 1氺 0
    [0131] U - 7： P J Τ Ρ S 2 - 2 0
    [0132] U 一 7： P J Τ Ρ S 2 - 3氺 0
    [0133] U 一 7： P J Τ Ρ S 2 - 4 * 0
    [0134] c ) ト マ ト に 対 す る 病 原 性 — 2
    [0135] 上 記 （ 5 ) で 得 ら れ た 形 質 転 換 体 と Μ 4 S 菌 ぉ よ び U — 7 菌 を、 播 種 後 4 週 間 の ト マ ト の 幼 苗 に 有 傷 接 種 し 病 原 性 を 検 討 し た。
    [0136] 播 種 後 4 週 間 の 卜 マ ト に 対 す る 各 菌 種 の 病 原 性 を 第 3 表 に 示 す。 第 3 表 中、 * 印 は 形 質 転 換 体 を 示 す。
    [0137] 第 3 表 に 示 す よ う に、 U — 7 菌 を 接 種 し た ト マ 卜 は 1 週 間 後 に は 1 0 0 % 発 病 し 萎 凋 し た 力 形 質 転 換 体'と Μ 4 S 菌 は 全 く 病 徴 を 示 さ な か っ た。 第 3 表
    [0138] d ) タ バ コ に 対 す る 病 原 性
    [0139] 上 記 （ 5 ) で 得 ら れ た 形 質 転換 体 と M 4 S 菌 ぉ よ び じ 一 7 菌 を、 播 種 後 1 0 週 間 の タ バ コ に 葉 肉 注射 す る こ と に よ っ て 接 種 し、 病 原 性 を 検 討 し た。
    [0140] そ の 結果、 じ 一 7 菌 を 接 種 し た タ バ コ は 発病 し て 萎 凋 し た が、 形 質 転換 体 と M 4 S 菌 は 全 く 病 徴 を 示 さ な 力、 つ た。
    [0141] 以 上 の a ) 〜 d )の 結 果 か ら 明 ら か な よ う に、 ブ ラ ス ミ ド p J T P S 2 に よ っ て 得 ら れ た 形質 転 換体 は 完 全 な 非 病 原 性 菌 で あ つ た。
    [0142] 7. 産 業上 の 利 用 可 能 性
    [0143] 以 上 の よ う に、 こ の 発 明 の プ ラ ス ミ ド p J T P S 1 は シ ユ ー ド モ ナ ス 属 の 病原 細 菌 を 非病 原 性 化 す る こ と が可 能 で あ り、 生 物防 除 用 の 細 菌 を 作 出 す る ベ ク タ ー と し て 有 利 に 使用 す る こ と 力 で き る。 ま た、 プ ラ ス ミ ド p J T P S 2 は、 p J T P S 1 に ハ イ グ ロ マ イ シ ン 耐 性 遺 伝 子 を 発 現 し 得 る 形 で 組 み 込 ん で あ る の で、 生 物 防 除 用 の 細 菌 を 容 易 に 作 出 す る べ ク タ 一 と し て 有 利 に 使 用 す る こ と 力 で き る。
    [0144] し た 力 つ て、 上 記 い ず れ か の プ ラ ス ミ ド が 導 入 さ れ た こ の 発 明 の シ ユ ー ド モ ナ ス 属 細 菌 の 形 質 転 換 体 は、 非 病 原 性 で あ る。
    权利要求:
    Claims請 求 の 範 囲
    1. シ ユ ー ド モ ナ ス · ソ ラ ナ セ ァ ラ ム
    Pseudomonas solanacearum) の 非炳-原 性突 然 変異 株 で あ る M 4 S ( 微ェ 研 条 寄第 7 0 0 号， F E R M B P — 7 0 0 ) 由 来 の プ ラ ス ミ ド で あ っ て、 シ ユ ー ド モ ナ ス 属 の 病 原 性 細 菌 を 非 病 原 性 化 し、一 無 毒 化 す る プ ラ ス ミ ド。
    2. E c 0 R I に よ る 切 断位 置 を 起 点 と し て、
    1 . 1 3 k b p に P s t I、 1 . 7 8 k b p に S t u I 、 1 . 8 3 k b p に h o I、 2 . 2 4 k b p に P s t I、 3 . 1 1 k b p に A p a I、 3 . 4 3 k b p に P s t I、 3 . 5 7 k b p に H i n d m、 3 . 7 5 k b p に E c o R V、 お よ び 3 . 9 7 k b p に P s t I に よ る 切 断 位 置 を 有 し、 力、 つ 分 子量 が 約 6 . 6 2 k b p で あ る 請 求 の 範 囲 第 1 項記載 の プ ラ ス ミ ド。
    3. 薬 剤 耐 性 遺 伝 子 お よ び 該遺 伝 子 の プ ロ モ-ー 夕 一 遺 伝 子 が さ ら に 組 み 込 ま れて い る 請 求 の 範 囲 第 1 項記 載 の プ ラ ス ミ ド。
    4. E c 0 R I に よ る 切 断位 置 を 起 点 と し て、
    1 . 1 3 k b p P s t I、 1 7 8 k b p に S t u I 、 1 . 8· 3 k b p に X h o I、 2 . 2 4 k b p に P s t I、 3 . 1 1 k b p に A p a I、 3 . 4 3 k b p に P s t I、 3 . 5 7 k b p に H i n d ffl、 3 .5 7 k b p に P s t I、
    3 . 8 7 k b p に E c o R V、 4 . 2 2 k b p に E c o R I、 4 . 4 7 k b p に E c o R I、
    4 .6 0 k b p に P s t I、 5 . 0 7 k b p に S a c Π 、 5 . 5 6 k b p に R s a I、 5 . 8 3 k b p に S a 1 I、 6 . 2 2 k b p に E c o R V、 お よ び 6 . 4 4 k b p に P s t I に よ る 切 断 位 置 を 有 し、 か つ 分 子 量 力 約 9 . 0 9 k b p で あ る 請 求 の 範 囲 第 3 項 記 載 の プ ラ ス ミ ド。
    5. シ ュ 一 ド モ ナ ス 属 細 菌 の 非 病 原 性 形 質 転 換 体 で あ っ て、 そ の 菌 体 内 に 請 求 の 範 囲 第 1 項 記 載 の プ ラ ス ミ ド を 有 す る 非 病 原 性 形 質 転 換 ί
    6. シ ュ 一 ド モ ナ ス 属 細 菌 の 非 病 原 性 形 質.転 換 体 で あ っ て、 そ の 菌 体 内 に 請 求 の 範 囲 第 3 項 記 載 の プ ラ ス ミ ド を 有 す る 非 病原 性 形 質 転 換
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    1992-11-11| WWP| Wipo information: published in national office|Ref document number: 1992902480 Country of ref document: EP |
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    申请号 | 申请日 | 专利标题
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